Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные ДНК

Учебные материалы по биологии / Генная инженерия / Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные ДНК

Страница 1

Идентификация клонов, несущих нужные гибридные (рекомбинантные) молекулы ДНК, называется скринингом.

Фенотипический скрининг. Этот метод требует наличия в гибридной молекуле одного или более маркёров. Под маркёром в данном случае понимается ген, кодирующий легко обнаруживаемый фенотипический признак. Клоны, имеющие данный признак (или признаки) являются обладателями нужной гибридной молекулы.

Часто в качестве маркёров выступают гены, обуславливающие устойчивость клеток к определенным антибиотикам или антиметаболитам. При высеве на питательную среду, содержащую этот антибиотик или антиметаболит, будут расти только клетки трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции отработана для бактерий, так как получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу к нескольким антибиотикам. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности.

Например, если векторная плазмида детерминирует устойчивость одновременно к тетрациклину и ампициллину (ТсrАрr) и при встройке в нее чужеродного фрагмента нарушается ген устойчивости к ампициллину, то гибридная плазмида будет обусловливать фенотип клетки-хозяина ТсrАрs, т. е. устойчивость к тетрациклину и чувствительность к ампициллину. Плазмиды после встройки в них фрагментов ДНК вводят в клетки, культуру высевают на чашки с агаризованной питательной средой, в которую добавлен тетрациклин. При этом вырастают колонии клеток, содержащих или исходную векторную плазмиду, или гибридные плазмиды. Затем колонии перепечатывают на чашки с ампициллином и чашки с тетрациклином. Те колонии, которые после перепечатки будут расти на среде с тетрациклином и не дадут роста на среде с ампициллином, содержат гибридные плазмиды. Простота манипуляций обусловила широкое использование данного типа векторов для клонирования самых различных фрагментов ДНК. Однако такие плазмиды не позволяют осуществлять прямой отбор гибридных клонов - сразу после высева трансформантов на селективную среду и появления колоний.

В последние годы получен ряд векторных плазмид, предназначенных для прямой селекции трансформантов, содержащих гибридные плазмиды. Такие векторы обычно имеют гены, потенциально летальные для чувствительных клеток-реципиентов, и могут трансформировать эти клетки только после инактивации данных генов встраиванием в них фрагментов ДНК.

Скрининг с помощью гибридизации. Нужную нуклеотидную последовательность в образце ДНК можно обнаружить с помощью ДНК-зонда, спаривающегося только с искомой последовательностью. Для этого ДНК сначала переводят в одноцепочечную форму, подвергнув ее тепловой обработке или воздействию щелочью. В этих условиях водородные связи между основаниями разрываются и цепи расходятся (происходит денатурация). Если теперь медленно снизить температуру, то произойдет их воссоединение (ренатурация). При этом, если в растворе присутствует одноцепочечный ДНК-зонд, он тоже будет ренатурировать с ДНК, специфически спариваясь с комплементарными участками. В результате образуется гибридная ДНК, т. е. двухцепочечная молекула, цепи которой принадлежат двум разным ДНК (рис. 4).

Рис. 4. ДНК-гибридизация

Принцип метода. ДНК-мишень подвергают денатурации и одноцепочечные молекулы необратимо «пришивают» к твердой подложке (нитроцеллюлозному или найлоновому фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре. Провести гибридизацию непосредственно на поверхности питательной гелевой среды, на которой культивировались микроорганизмы, невозможно, поскольку зонд не может в нее проникнуть. Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Затем фильтр инкубируют с одноцепочечным ДНК-зондом, меченным радиоизотопом или другой меткой. Если нуклеотидные последовательности зонда и ДНК-мишени комплементарны, то происходит их спаривание (т. е. гибридизация). Гибридные молекулы можно визуализировать радиоавтографическим или другим методом, зависящим от природы метки.

Радиоавтографический метод широко применяется для локализации радиоактивного материала. Для регистрации радиоактивных зон на исследуемый образец накладывают рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. «Засвеченные» участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки.

Если комплементарность между зондом и ДНК-мишенью отсутствует, то гибридизации не происходит, и результат получается отрицательным.