Обсуждение результатов

Учебные материалы по биологии / Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул / Обсуждение результатов

Страница 1

Как видно из рис. 7-8, значения параметров I(0) и размеров (Rg) образующихся комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сначала почти линейно увеличиваются при повышении концентрации ПЭГ до 10 мг/мл (1%), а затем рост размеров комплексов замедляется и почти полностью прекращается, а значения I(0), наоборот, начинает резко возрастать. Также следует отметить, что полученные в экспериментах кривые титрования объединенной сыворотки различными ПЭГ заметно отличаются между собой.

Для получения информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками использовали экспериментальные данные СР, приведенные на рис. 7-8, и рассчитанные из них значения параметра 1014*I(0)/Rg6, пропорционального среднему значению физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сыворотки крови с ПЭГ (см. рис. 9). Действительно, поскольку I(0) ~ n · M2 ~ n · V2, где M и V - средние молекулярные массы и объемы образующихся комплексов, то отношение I(0)/Rg6 с точностью до калибровочного коэффициента характеризует значение физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях. Из рис. 9 видно, что после первых же порций ПЭГ в смесях титр резко падает (это связано с образованием более крупных комплексов из отдельных сывороточных белков и аутоиммунных комплексов). Далее процесс падения замедляется, а при концентрациях 10 мг/мл и выше начинается резкое увеличение титра комплексов но, как видно из рис. 10, размер комплексов при этом остается почти неизменным. Следует отметить, что в отличие от графиков рис. 7 и 8, графики физического титра комплексов «ПЭГ-белки» на рис. 9 почти совпадают между собой. Поскольку представленные на рис. 7-9 экспериментальные данные соответствуют допреципитационным (равновесным) стадиям взаимодействия сыворочных белков с ПЭГ, то все они свидетельствуют о сходстве их молекулярных механизмов взаимодействия.

Как видно из рис. 10, при концентрациях ПЭГ-6000 в диапазоне 6 ÷ 8% (60 ÷ 80 мг/мл) происходит полная преципитация фракций модифицированных ЛП в нативной объединенной сыворотке крови и при дальнейшем увеличении концентрации ПЭГ-6000 эффект преципитации остается неизменным. А вот для других ПЭГ, а именно, ПЭГ-1000, 4000 и 8000 преципитация фракций модифицированных ЛП происходит при значительно более высоких концентрациях соответствующих ПЭГ и при том не полная (см. табл. 3). Для ПЭГ-20000 эксперименты с применением методов СР и МУРР вообще не удалось провести из-за сильной агрегации этого ПЭГ с сывороточными белками уже при самых малых концентрациях ПЭГ, в результате чего также резко повышается вязкость растворов. Поэтому применение именно ПЭГ-6000 для целей препаративного выделения и анализа модифицированных ЛП вполне обосновано [1-3]. Кроме того, подтвердились данные, что концентрация ПЭГ-6000, при которой происходит полное отделение модифицированных ЛП от немодифицированных, равна 6-8% [1, 2].

В табл. 3 приведены значения степени модификации фракций ЛП используемой в работе объединенной сыворотки пациентов с нормолипемией. Степень модификации наименьшей оказалось у фракции ЛПВП (44%), а наибольшей - у ЛПОНП (~100%) и в целом около 68% ЛП оказались «чужеродными» ЛП. Такой результат не соответствует ранее полученным данным [3, 4, 21], где только около 40% ЛП модифицированы у пациентов с нормолипемией. Связано это, по-видимому, с тем, что в данной работе использовали объединенную сыворотку, в которой образовалось много дополнительных комплексов ЦИК «ЛП - антитело», которые также преципитировали с ПЭГ и привели к завышенным значениям степени модификации.

Из полученных в работе результатов видно, что, как и отмечалось в работах [1, 2] при различных концентрациях ПЭГ происходит образование различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 10 мг/мл (1%)) приводят к образованию комплексов крупных размеров, 1-2% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров, а более высокие концентрации (> 20 мг/мл) вызывают, по-видимому, преципитацию более низкомолекулярных белковых фракций.