Электрофорез

Учебные материалы по биологии / Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии / Электрофорез

Страница 1

Молекулы ДНК представляют собой полианионы, которые в электрическом поле движутся к аноду. ДНК (одно- и двухцепочечные) движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные. Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот пропорционально их длине. После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия.

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле продуктов ПЦР необходимы следующие реактивы:

· 3%-ый APS

Аммоний персульфат 0,2г

Дистиллированная вода 5мл

· 30%-ый акриламид:бисакриламид 29:1

Акриламид 29г

N,N’-Метилен-бис-акриламид 1г

· Краска для нанесения проб

Глицерин 30г

Бромфеноловый синий 250мг

Ксиленцианол 250мг

Дистиллированная вода 70мл

· 10-кратный ТВЕ-буфер

Трис-НСl 54г

ЭДТА-натриевая соль 4,65г

Борная кислота 27,5г

Дистиллированная вода до 500мл

Разделяющий 6%-ый ПААГ (заливка стекол). На 100 мл (2 стекла) необходимо:

%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 20мл

х ТВЕ 10мл

%-ый APS 4 мл

Н2О 66мл

ТEMED 60мкл

%-ый ПААГ (пробка). На 8 мл (2 стекла) необходимо:

х ТВЕ 800мкл

%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 7,2мл

%-ый APS 400мкл

ТEMED 10мкл

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле осуществляли следующие процедуры.

. Подготовка камеры для вертикального электрофореза (Приложение 6 и 7).

Собирали камеру для вертикального электрофореза на два геля. Если необходим только один гель, вторую пару стекол заменяли одним квадратным стеклом. Важно, чтобы стекла были чистыми без ворсинок и пятен. На стол плашмя клали остов камеры, накрывали его стеклом с «рогами», совмещая с боковыми и нижним контурами остова. Вдоль боковых сторон стекла помещали по спейсеру и накрывали стеклом без выемки. Совмещали с помощью скальпеля края стекол и спейсеров, так чтобы последние не выглядывали (особо нижний край). Закрепляли стекла на остове прищепами «бульдог» по середине. Переворачивали конструкцию закрепленными стеклами на стол и повторяли процедуру с другой парой стекол. Окончательно выравнивали стекла так, чтобы поставленная на ровную поверхность камера не качалась. После этого закрепляли стекла с каждой стороны еще двумя парами «бульдогов». Камера готова к работе.

. Проводили пролимеризацию полиакриламидной пробки. Для этого на ровную поверхность (например, нижняя сторона поддона от камеры) наносили по разметке две дорожки 26%-ого ПААГ и вдоль них опускают дно камеры. Гель поднимается между стеклами на высоту около 1 см. Для застывания гелевой пробки камеру оставляли на 20 минут. Затем камеру с пробкой заливали разделяющим 6%-ым ПААГ. Для удобства гель рекомендуется заливать 20 ил 10-кубовым шприцем по внутренней стороне цельного стекла. Верхняя граница геля должна совпадать с верхней границей «рогатого» стекла. Заливали гель равномерно, стараясь не допускать попадания пузырьков воздуха. Сверху между стекол вставляют гребенку, ориентируясь по верхнему краю рогатого стекла, и давали гелю застыть около 1 часа. Камеру с гелем помещали в поддон и заливали её и ёмкость поддона 1-кратным ТВЕ буфером. Гребенки вынимали строго вертикально. Через клеммы камеру подключали к источнику питания.