Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул

Учебные материалы по биологии / Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул

Введение

Процессы, связанные с обменом липидов в организмах, относятся к важнейшим метаболическим процессам. Известно, что различные типы нарушений липидного обмена сопровождаются изменениями фракционного и субфракционного состава сывороточных липопротеинов (ЛП) крови [1-13]. Выявлено участие ЛП в механизмах нарушения липидного обмена, сопровождающих развитие не только атеросклероза, но и целого ряда других патологий (диабет, гепатит, панкреатит и др.). Поэтому для диагностики и профилактики заболеваний людей и животных, а также для оценки эффектов лечений имеется острая необходимость точно и быстро (экспрессно) определять фракционный состав липопротеинов в сыворотках крови. Авторами работ [16-20] была разработана новая методика анализа структуры и фракционного состава ЛП на основе дифракционного метода МУРР. Методика не требует применения дорогостоящих реактивов и позволяет относительно быстро определять фракционный состав ЛП в прямой шкале размеров (радиусов) ЛП частиц и в абсолютных единицах концентраций (мг/дл). В работах [3, 4, 21] было показано, что кровь здоровых людей также содержит до 40% так называемых модифицированных липопротеинов. В связи с этим для диагностики дислипопротеинемий (ДЛП) необходимо измерять концентрации не только общих, но и модифицированных липопротеинов, причем во всех основных фракциях и подфракциях липопротеинов.

Для препаративного выделения модифицированных ЛП из сывороток крови используют полиэтиленгликоли (ПЭГ). Известно, что растворы полиэтиленгликолей способны осаждать из сывороток крови агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы [1-6]. При различных концентрациях ПЭГ происходит преципитация различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 3%) осаждают комплексы крупных размеров, высокие концентрации (> 6%) вызывают преципитацию и низкомолекулярных соединений, а 3,5% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров.

Дифракционные методы изучения строения нано-частиц вещества, основанные, в частности, на рентгеновском или световом рассеянии, позволяют проводить всесторонние исследования макромолекул в растворе. При рассеянии под малыми углами можно изучать их общее строение, а под средними и большими - особенности их внутренней структуры [14, 15]. Благодаря этому данные методы получили весьма широкое распространение. Дифракционные методы дают информацию о структуре и взаимном распределении рассеивающих масс (неоднородностей электронной или оптической плотности) - информацию, которую невозможно получить другими (недифракционными) методами. Эти физические методы анализа позволяют проводить научные исследования внутренней структуры и дисперсного состава веществ и материалов различных типов: коллоидные растворы и гели биополимеров (белки, нуклеиновые кислоты, вирусы, клетки), а также взвеси органических и неорганических частиц. Исследования и анализы дифракционными методами проводятся с использованием специальных приборов - дифрактометров [14, 15].

Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) позволяет непосредственно определять значения структурных параметров частиц размером от единиц до нескольких тысяч ангстрем. В этот диапазон, как известно, попадают все белки, нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды, липопротеиды и другие макромолекулярные комплексы, а также малые и средние вирусы. С использованием метода МУРР могут быть получены такие важные характеристики биополимеров, как молекулярный вес, размеры, объём, форма частиц, дисперсный состав (распределение по размерам) и целый ряд других параметров [14].

Метод светорассеяния (СР) отличается высочайшей чувствительностью, а применение более длинноволнового излучения (по сравнению с МУРР; отличие может составлять тысячи раз) позволяет определять структурно-дисперсные характеристики рассеивающих частиц размером от 40 нм до нескольких микрон и более [15]. Кроме того, существуют и чисто физические отличия в механизмах взаимодействия излучений с веществом анализируемых частиц: рассеяние в МУРР происходит на неоднородностях электронной плотности, а в СР - на неоднородностях оптической плотности, отличающихся показателями преломления. Поэтому эти два дифракционных метода хорошо дополняют друг друга [14, 15].

Целью настоящей дипломной работы является изучение равновесных и неравновесных молекулярных взаимодействий биологических макромолекул (сывороточных белков крови) с полиэтиленгликолями различной молекулярной массы, включающее следующие задачи:

1.      Освоение двух дифракционных методов анализа (МУРР и СР) и новых методик анализа сывороточных белков крови, в частности, липопротеинов (общих и модифицированных).

2.      Исследование эффектов молекулярных взаимодействий белков сывороток крови с различными полиэтиленгликолями в допреципитационных и преципитационных стадиях.

.        Математический и статистический анализ полученных экспериментальных данных.

.        Выбор «оптимального» полиэтиленгликоля (определенной молекулярной массы) и определение его оптимальной концентрации для препаративного выделения и анализа модифицированных липопротеинов.

1. Обзор литературы

• Физико-химические свойства полиэтиленгликолей
• Сывороточные белки крови, их классификация и функции
• Общие и модифицированные ЛП
• Методы рентгеновской и оптической дифракции
• Измерение рентгенограмм рассеяния от анализируемых образцов
• Измерение индикатрисс светорассеяния
• Титрование сывороток крови полиэтиленгликолями
• Экспериментальные данные по светорассеянию
• Анализ общих и модифицированных ЛП методом МУРР
• Обсуждение результатов