Свойство и структура ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha

Учебные материалы по биологии / Генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов / Свойство и структура ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha

Страница 1

В настоящее время выделено и охарактеризовано более 50 структурных генов синтаз из разных микроорганизмов. ПГА - синтаза из R.eutropha состоит из одного типа субъедениц с молекулярной массой около 64 кДа и кодируется геном phbC. В клетке ПГА - синтаза находится в двух формах: растворимой и связанной с гранулами полимера. Обе формы наиболее активно используются для построения полимерных молекул короткоцепочечных (от 3 до 5 атомов углерода) 3-гидроксиацил-КоА и это свидетельствует о строгой специфичности фермента к короткоцепочечным производным. Эти данные были подтверждены в системе синтеза полимера in vitro. ПГА - синтаза, выделенная из рекомбинантного штамма Е. coli, с трансформированным ПГА - синтазным геном из R.eutropha, высокоактивна с 3-ОН-С4-КоА и 3-ОН-С5-КоА субстратами. С 3-ОН-С6-КоА активность фермента резко снижается и составляет всего 0.94% от таковой с гидроксибутират-КоА. Наибольшее сродство фермент имеет по отношению к кислотам с ОН-группой в β-положении. Перемещение ОН-группы к метильному концу снижает способность субстрата связываться с ферментом, однако не влияет на скорость синтеза полимера. Также доказано, что локализация гидроксила у карбоксильного конца полностью дезактивирует фермент. К настоящему моменту показано, что субстратная специфичность ПГА - синтазы in vivo может существенно отличаться от ее характеристик in vitro. ПГА - синтаза in vivo может включать в полимер в небольших количествах и более длинные гидроксикислоты - С6, С8 и С10. Это свидетельствует о более широком спектре субстратов, используемых синтазой для построения полимеров. Разница в субстратной специфичности фермента in vivo и in vitro может быть связана со сроками наблюдения за включением субстратов в ПГА, или разницей в специфической среде окружения фермента. Полученные данные свидетельствуют о конститутивном синтезе ПГА-синтазы. Например, в условиях лимита по углероду R.eutropha синтезирует преимущественно растворимую форму фермента, а при переносе культуры в условия дефицита азота, активность растворимой ПГА-синтазы резко падает, и в клетках в основном определяют гранулозависимую форму фермента. При этом суммарная активность фермента остается на одном и том же уровне (0.05 u/mg protein). Растворимую форму ПГА-синтазы в достаточном количестве выделили из рекомбинантного штамма Е. coli, который содержал ПГА - синтазный ген. Рекомбинант оказался способным синтезировать фермент с высоким выходом, но так как в среде отсутствовали субстраты, в клетках накапливалась только растворимая форма фермента. Молекулярный вес растворимой синтазы составляет 64 кДа. Кинетический анализ показал, что реакция полимеризации 3-ОН-С4-КоА с этим ферментом начинается после достаточно продолжительной лаг фазы, которая увеличивалась при снижении концентрации фермента в реакционной смеси. Эти наблюдения позволили предположить, что для сокращения длительности лаг фазы необходим праймер, который позволил бы переводить фермент из мономерного в димерное состояние. И, действительно, использование в реакции полимеризации олигомера 3-ОН-С4 исключило лаг фазу, а в реакционной смеси при этом обнаружили мономерные и димерные формы фермента. К настоящему времени доказано, что только димерная форма фермента обладает каталитической активностью. Это хорошо согласуется с механизмом реакции полимеризации, согласно которому в реакцию полимеризации должны включаться две тиольные группы. Однако у ПГА - синтазы обнаружен только один цистеин в положении 319, отвечающий за образование полимерных цепей. Достаточно много было выдвинуто предположений о посттрансляционных модификациях фермента пантотеновой кислотой, которая могла бы ввести вторую тиольную группу для успешной работы фермента. Однако наиболее доказательной оказалась модель образования активного фермента в виде димера, у которого две тиольные группы расположены в Cys319, локализующие в консервативном участке субъединиц. На основании этих данных была предложена модель - механизм полимеризации мономеров, аналогичный синтезу ацильных цепей жирных кислот, согласно которой димеризация ПГА - синтазы необходима для формирования активного центра с двумя идентичными тиольными группами. Последние образуют сайты связывания с субстратом и растущей полимерной цепью, при этом растущая цепь переходит с одной тиольной группы на другую. Растущая цепь полимера стабилизирует димерную структуру фермента; последний находится в клетке в гранулосвязанной форме и локализуется на поверхности полимерных гранул.