Амплификация последовательности ДНК in vitro

Учебные материалы по биологии / Генная инженерия / Амплификация последовательности ДНК in vitro

Страница 1

Для решения широкого круга задач, связанных с изучением и модификацией генома, довольно часто возникает необходимость получения множества копий определенного фрагмента ДНК. Процесс многократного копирования данного фрагмента называется амплификацией.

Амплификация ДНК методом ПЦР. Ферментативный метод амплификации фрагментов ДНК, получивший название полимеразной цепной реакции (ПЦР), был разработан К. Маллисом с сотрудниками в 1985 г.

Процедура состоит из многократного последовательного повторения трех реакций: денатурации, ренатурации и синтеза (рис. 7).

К целевому образцу двунитевой ДНК добавляют в избыточном количестве два синтетических олигонуклеотида-праймера, размером около 20 нуклеотидов, каждый из которых комплементарен одному из 3'-концов антипараллельных цепей целевого сегмента ДНК.

Препарат подвергают термической денатурации, выдерживая его при температуре 95º С в течение 1 минуты, затем медленно охлаждают до ~55º С. При этом в процессе отжига (ренатурации), происходит гибридизация олигонуклеотидов-праймеров с комплементарными последовательностями нитей целевой ДНК. После этого вносят фермент ДНК-полимеразу и дезоксинуклеозидтрифосфаты, служащие «строительным материалом», что запускает реакцию синтеза комплементарных цепей целевой ДНК.

После завершения синтеза, вновь повторяют денатурацию и ренатурацию, что приводит к гибридизации праймеров, находящихся в избытке, не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в препарат новой порции ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. При использовании термостабильных полимераз (например, Taq, выделенной из термофильных бактерий Thermus aquaticus), повторного внесения фермента в каждом новом цикле не требуется.

Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного синтеза. При этом число амплифицируемых сегментов ДНК с каждым циклом удваивается (увеличивается экспоненциально). Таким образом, используя ПЦР, можно in vitro обогащать препарат ДНК целевым фрагментом в миллион и более раз.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически. Каждый цикл обычно длится 3-5 мин.

Рис. 7. Схема амплификации ДНК методом ПЦР (показаны первые два цикла)

К недостаткам метода можно отнести то, что при полимеразной реакции происходят ошибочные включения некомплементарных нуклеотидов в цепь с частотой 1,1 · 10-5 в одном цикле. Синтезированные последовательности ДНК, содержащие ошибки, в следующих циклах ПЦР амплифицируются экспоненциально. После 30 циклов частота ошибок в амплифицированной ДНК может достигать 0,25 %.

Преодолеть данную проблему можно добавлением в препарат дополнительного фермента - полимеразы GB-D, выделенной из Pirococcus sp. GB-D обладает корректирующей 3'-5'-эндонуклеазной активностью и может удалять ошибочно введенные некомплементарные нуклеотиды из растущей цепи ДНК.

Метод ПЦР находит самое разнообразное использование в молекулярной биотехнологии. Он используется для секвенирования, для повышения эффективности клонирования целевых фрагментов геномов, для детекции патогенных микроорганизмов, для тонкого анализа хромосомной рекомбинации и т.д. С помощью этого метода удалось клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков человека возраст которых семь тысяч лет! В генетическом анализе, позволяющем установить отцовство или выявить преступника, также используется метод ПЦР.