Методы введения рекомбинантных ДНК в клетки

Учебные материалы по биологии / Генная инженерия / Методы введения рекомбинантных ДНК в клетки

Страница 1

Для введения в клетку рекомбинантных ДНК, сконструированных на основе бактериальных и дрожжевых плазмид или вирусов эукариот, разработано множество различных по своей эффективности и сложности методов. Процесс проникновения экзогенной ДНК в клетку называется трансформацией, а трансформированные клетки принято называть трансформантами. Термином трансфекция обозначается введение в клетки ДНК или РНК вируса с последующим образованием вирусного потомства. Эффективность трансформации обычно невысока. Рекомбинантный геном включается в среднем лишь в одну из примерно 1000 клеток. Однако данный недостаток компенсируется применением эффективных методов скрининга, позволяющих быстро идентифицировать трансформированные клетки.

Трансформация чужеродной ДНК происходит только в компетентные клетки, то есть в те клетки, стенки которых стали проницаемыми для ДНК.

Метод CaCl2-зависимой трансфекции. Разработан М. Манделем и А. Хигом в 1970 г. Клетки бактерий подвергаются обработке ледяным (0° С) раствором CaCl2 с последующим выдерживанием при 42°С в течение 1,5 минут (тепловой шок). При этом происходит локальное разрушение клеточной стенки и клетки становятся способными к поглощению молекул ДНК из внешней среды. Наиболее успешно происходит поглощение фаговой ДНК, несколько хуже - плазмидной. Эффективность метода составляет до 10-4 БОЕ на одну молекулу ДНК фага λ.

Метод ЭДТА-лизоцимных сферопластов. Сферопласты - живые бактериальные или дрожжевые клетки, с почти полностью разрушенной клеточной стенкой. Обычно сферопласты бактерий получают путем обработки клеток раствором бактерицидного фермента лизоцима. Лизоцим гидролизует пептидогликан стенок бактерий, разрушая полисахаридные цепи до дисахаридных фрагментов. Внешняя мембрана грамнегативных бактерий защищает пептидогликановый слой от воздействия ферментов. Поэтому перед использованием лизоцима клетки грамнегативных бактерий обрабатывают комплексообразующим агентом этилендиамининтетраацетатом (ЭДТА), который связывает двухвалентные ионы, стабилизирующие внешнюю мембрану. В результате часть липополисахаридов высвобождается из мембраны и она становится проницаема для лизоцима.

Эффективность метода составляет до 10-3 БОЕ на одну молекулу ДНК фага λ, что на порядок выше, чем при использовании метода CaCl2-зависимой трансфекции, однако, из-за сложности и плохо воспроизводимых результатов данный метод не получил широкого распространения.

Электропорация. Это физический метод повышения компетентности клеток путем кратковременного (5-20 мс) воздействия на них электрическим полем высокой напряженности (1-15 кВ/см). При этом в результате электропробоя происходит образование пор в липидных мембранах. Количество трансформантов при этом может достигать 80 % выживших клеток - столь высокой результативности не удается добиться иными существующими методами.

В настоящее время электропорация благодаря простоте и эффективности становится наиболее популярным методом трансформации как про-, так и эукариотических клеток, чему способствует также серийное производство электропораторов.

ДЭАЭ-декстрановый метод. Применяется для введения ДНК в клетки млекопитающих. Открыт в 1968 г. Дж. Мак-Катченом и Дж. Пагано.

Поликатион диэтиламиноэтилдекстран (ДЭАЭ-декстран) значительно увеличивает эффективность трансфекции клеток животных нуклеиновой кислотой вируса SV40. Очищенную ДНК вируса SV40 инкубируют сначала в растворе с ДЭАЭ-декстраном, варьируя его концентрацию от 100 до 3000 мкг/мл. Затем эту смесь наносят на монослой клеток, который через определенный промежуток времени отмывают от поликатиона и заливают средой. В процессе последующей инкубации на монослое появляются бляшки лизированных клеток. Эффективность трансфекции ДНК вируса SV40 таким методом составляет (1-10) · 106 БОЕ на 1 мкг ДНК. На эффективность трансфекции влияют молекулярная масса (наилучшие результаты достигаются при использовании поликатиона с молекулярной массой 106 Да) и концентрация применяемого ДЭАЭ-декстрана.

Механизм действия ДЭАЭ-декстрана окончательно не установлен, но известно, что он связывается с нуклеиновыми кислотами и частично предохраняет их от деградации нуклеазами. ДЭАЭ-декстран также взаимодействует с клеточной мембраной и, по-видимому, за счет этого увеличивает эффективную концентрацию ДНК на поверхности клеток и стимулирует пиноцитоз, хотя сам при этом клетками не захватывается.