Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Учебные материалы по биологии / Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии / Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Страница 1

Принцип метода полимеразной цепной реакции (Polymerase chain reaction) был разработан Кэри Мюллисом (США) в 1983 г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе госэпидемнадзора. Метод очень эффективен для изучения полиморфизма ДНК. Он позволяет относительно легко и быстро амплифицировать нужные нуклеотидные последовательности из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.

Для реализации ПЦР необходимы следующие компоненты:

― ДНК-матрица (ДНК или её часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

― праймеры (синтетические олигонуклеотиды, включающие 20-30 пн, комплементарные последовательностям ДНК на границах определённого специфического фрагмента);

― смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), т. е. смесь четырёх дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

― фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из термофильных бактерий Thermis aquaticus, катализирующая удлинение цепей праймеров путём последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).

― буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Мg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Нами были использованы пять праймеров для выявления микросателлитных локусов, характеристики которых отображены в таблице 5.

ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах (Приложение 1):

. денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93- 95°С в течение 30-40 сек.

. присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига ― 20-60 сек.

. достраивание цепей ДНК (синтез новых цепей). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5/- конца к 3/- концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Процесс синтеза, катализируемый Taq-полимеразой, проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза 20-40 сек.

Таблица 5. Характеристика микросателлитных локусов

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n ― число циклов амплификации (экспотенциальное увеличение числа цепей). Поэтому, если в исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт” (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Дело в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции. Для этого применяется HotTaq полимераза (химически модифицированная), которая неактивна до начала ПЦР.