Общая методология выделения и очистки полисахаридов

Учебные материалы по биологии / Получение внеклеточных полисахаридов / Общая методология выделения и очистки полисахаридов

Страница 2

Экстракция полисахаридов сопровождается растворением полярных низкомолекулярных соединений, некоторых белков и нуклеиновых кислот, поэтому дальнейшая обработка экстракта предусматривает удаление этих веществ.

) выделение полисахарида из смеси в виде осадка. Так, хитин и целлюлоза сохраняют целостность структуры при жёсткой щелочной или окислительной обработке, которая приводит к деструкции остальных биополимеров.

Экстракция требует предварительного измельчения сырья; при этом часть фибриллярных молекул может быть повреждена либо механическим путём, либо окислением кислородом воздуха (последнее - в щелочной среде).

Необходимость в экстракции отпадает при выделении полисахаридов из жидкостей биологического происхождения, где они изначально находятся в растворе (культуральные жидкости, плазма крови и т.п.).

Осаждение. Перевод вещества из раствора в осадок можно осуществить несколькими путями:

) нагревание экстракта/исходной смеси с последующим охлаждением. В ходе данной процедуры выпадают в осадок полисахариды, растворимость которых в горячей воде значительно выше, чем в холодной: β-глюкан из овса, инулин и др.

) осаждение органическим растворителем, смешивающимся с водой. Обычно применяют 80% этанол, который растворяет низкомолекулярные примеси, в т. ч. олигосахариды, в то время как полисахариды выпадают в осадок.

) фракционное осаждение. В этом случае получают серию фракций осаждаемых веществ, соответствующих разным концентрациям осадителя в растворе; в каждой фракции содержание целевого полисахарида выше, чем в предыдущей. Данный способ может быть пригоден для разделения смеси полисахаридов. Например, кислые полисахариды могут быть отделены от нейтральных в виде нерастворимых кальциевых или бариевых солей.

) добавление комплексообразователей. Остатки уроновых кислот и моносахаридов с соседними цис-гидроксильными группами образуют нерастворимые комплексы с ионами меди; высокомолекулярные комплексообразователи (галактоманнан, амилоза) взаимодействуют таким же образом с целлюлозой, и т.п. [4] Наиболее избирательным методом такого осаждения является применение антисывороток. [3]

В результате осаждения полисахаридов из первичных экстрактов часто получают смеси, загрязнённые неуглеводными примесями, в первую очередь белком и неорганическими солями, поэтому необходимо подвергнуть экстракт предварительной обработке посредством диализа, ультрафильтрования или ферментативной очистки.

Диализ. В процессе диализа раствор экстракта помещают в целлофан, погружённый в воду; при этом низкомолекулярные примеси диффундируют через целлофан наружу. Диффузия ускоряется под действием электрического поля (электродиализ) или при перемешивании. Для удаления катионов из растворов кислых полисахаридов диализ проводят в подкисленной среде.

Ультрафильтрование представляет собой фильтрование раствора через полупроницаемую мембрану с определённой величиной пор и так же позволяет избавиться от низкомолекулярных примесей.

Ферментативная обработка разрушает высокомолекулярные примеси, которые не удаётся удалить при помощи диализа. Очистка раствора от использованного фермента осуществляется одним из методов денатурации белков: нагревание, действие химических реагентов (щёлочи, трихлоруксусной кислоты, хлороформа с амиловым спиртом и т.д.), избирательная сорбция белков на геле фосфата кальция. [4] Эти же методы применяются для деструкции неферментных белков, загрязняющих раствор. [7]

Хроматография - разделение веществ, различающихся по определённым физико-химическим параметрам.

Вид хроматографии, основанный на разделении веществ по молекулярному весу - гель-фильтрация на сефандексе. Сефандекс - полусинтетический сорбент полисахаридной природы; его гранулы содержат поры и формируют т. н. “молекулярное сито”, которое задерживает внутри низкомолекулярные вещества и не препятствует диффузии полимеров. Существуют наборы сефандексов с различной величиной пор для разделения смеси полисахаридов. [4] Таким способом получают декстраны. [7]

Ионообменная хроматография позволяет разделить вещества в соответствии с их зарядом [7] (например, отделить кислые полисахариды от нейтральных). [4] Ионообменник - это твёрдый носитель заряженных групп, которые способны за счёт электростатистического взаимодействия связывать ионы исследуемых молекул. Таким образом, заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником и могут быть элюированы для дальнейшей обработки. [7]